在流式細(xì)胞檢測(cè)實(shí)驗(yàn)中,除了血液樣本,幾乎所有的樣本均為實(shí)體組織,如脾臟、肝臟、腎臟、脂肪、腫瘤等,那么為了做好流式的檢測(cè),我們首先得將實(shí)體組織消化成為活性較佳的單細(xì)胞懸液。
那么怎樣得到活性較佳的單細(xì)胞懸液呢?今天小晶為大家?guī)砜蛻糇稍兌嗟膶?shí)體組織的單細(xì)胞懸液提取,以小鼠脾臟、小鼠腫瘤組織的提取為例,感興趣的話就跟小晶一起往下學(xué)習(xí)吧。
一、小鼠脾臟單細(xì)胞懸液制備
脾臟是體內(nèi)大的免疫器官,含有大量的淋巴細(xì)胞和巨噬細(xì)胞,是機(jī)體細(xì)胞免疫和體液免疫的中心,負(fù)責(zé)機(jī)體的造血、紅細(xì)胞清除和免疫功能。一般免疫研究者很難逃過對(duì)脾臟的研究,如調(diào)節(jié)性T細(xì)胞、輔助性T細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等的熱門研究,均有脾臟的身影,那么怎么獲得活性非常好的脾臟單個(gè)細(xì)胞呢?
詳情步驟:
① 獲取新鮮的小鼠脾臟,小鼠的脾臟呈橢圓形狀,可以直接用鑷子拉扯分離。將小鼠脾臟放入預(yù)冷的有適量 HBSS緩沖液的培養(yǎng)皿或大小適中的離心管中,并使用手術(shù)剪或眼科剪,小心將脾臟剪碎。
② 將細(xì)胞篩網(wǎng)放在50 mL 離心管上方,使用一次性移液器,將剪碎后的脾臟轉(zhuǎn)移到細(xì)胞篩網(wǎng)輕輕的搗碎或碾壓,使其通過篩網(wǎng)。必要時(shí),加入5–10 mL PBS 沖洗。重復(fù)上述步驟,可使用1 mL注射器進(jìn)行驗(yàn)證,若通過篩網(wǎng)的細(xì)胞懸液使用注射器(帶針頭)進(jìn)行反復(fù)吹打,則可認(rèn)為單細(xì)胞懸液制備完成。
③ 將流式細(xì)胞懸液在4°C下,以400-600 g 或1500 rpm 離心細(xì)胞10 min,棄上清,用2–5 mL 預(yù)冷的1x PBS 重懸細(xì)胞。將重懸液置于冰上備用,必要時(shí)可以對(duì)細(xì)胞進(jìn)行臺(tái)盼藍(lán)染色初步判斷活率,也可對(duì)細(xì)胞進(jìn)行單細(xì)胞計(jì)數(shù),調(diào)整至合適的細(xì)胞濃度后根據(jù)檢測(cè)實(shí)驗(yàn)?zāi)康姆謩e進(jìn)行染色、上機(jī)檢測(cè)。
二、小鼠腫瘤組織單細(xì)胞懸液制備
小鼠腫瘤發(fā)病特征和人類腫瘤很相似,因此對(duì)人類腫瘤的研究有很高的價(jià)值,而對(duì)應(yīng)的小鼠腫瘤動(dòng)物模型的類型及其建立方法,對(duì)腫瘤研究起到至關(guān)重要的作用。進(jìn)一步,如何更好地利用實(shí)驗(yàn)材料驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)論,關(guān)鍵在于對(duì)腫瘤組織的檢測(cè)方法。其中流式檢測(cè)腫瘤組織的免疫功能就成了超級(jí)熱點(diǎn),那么怎么才能得到活性較好的、干擾較少的腫瘤組織單細(xì)胞懸液用于流式檢測(cè)呢?跟小晶一起學(xué)習(xí)一下吧!
詳情步驟:
① 沿腫瘤組織輕輕剪開,盡可能完整的剝離整個(gè)腫瘤,將剝離好的腫瘤放入預(yù)冷的有適量 HBSS緩沖液的培養(yǎng)皿或大小適中的離心管中,盡量冰上放置保持細(xì)胞良好活性。
② 并使用手術(shù)剪或眼科剪,小幅度、高頻的方式將腫瘤塊剪碎,大約剪成<1mm2大小(肉眼看呈泥漿狀),整個(gè)過程建議在冰上操作,使用適量的 PBS 進(jìn)行洗滌,1500 rpm 離心10 min,沉淀的組織樣本待消化。
③ 每樣本加入2-3 mL 配置好的消化液(可根據(jù)腫瘤大小調(diào)整1×消化液的用量),用1 mL 槍頭將腫瘤組織碎末打散,置于37 °C 恒溫?fù)u床,300 rpm 搖晃,使酶與組織充分接觸,約消化30 min 左右,期間每15 min 取出吹打一次,可取一滴觀察細(xì)胞分離情況,從而適當(dāng)調(diào)整消化分離時(shí)間,消化時(shí)間不宜過長(zhǎng),以免影響免疫細(xì)胞活性。
④ 消化完畢后,加入3 mL(組織量過多可成倍加入含5%血清的 DMEM 終止消化。用巴氏吸管吸取消化后的腫瘤組織懸液至70 μm 細(xì)胞濾網(wǎng)過濾,同時(shí)用1 mL 注射器后部研磨遺留在濾網(wǎng)上的組織塊,所得懸液4 °C,50 g 離心10 min,收集上清,則為腫瘤細(xì)胞懸液。
⑤ 根據(jù)所購買的淋巴流式細(xì)胞分離液,對(duì)腫瘤懸液進(jìn)行 PBMC 的提取,提取出中間白膜層后根據(jù)檢測(cè)的實(shí)驗(yàn)?zāi)康姆謩e進(jìn)行染色、上機(jī)檢測(cè)。
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