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血清研究方法
更新時(shí)間:2015-05-25   點(diǎn)擊次數(shù):1201次

方 法:
一、免疫方法:根據(jù)抗原的性質(zhì)不同而異。下面以制備家兔抗人IgG免疫血清為例作具體說明。
(1)用剪刀剪去家兔兩后腳掌的部分兔毛,以酒精及碘酒消毒皮膚;
(2)*次免疫: 用2ml注射器吸取弗氏*佐劑(FCA)乳化的抗原(人IgG)下稱FCA-IgG)液1ml,每側(cè)腳掌皮下各注入0.5ml。
(3)第二次免疫:間隔10-14天后,于兩側(cè) 窩及鼠蹊部腫大的淋巴結(jié)內(nèi)注入FCA-IgG,每個(gè)淋巴結(jié)注0.1ml,其余注入淋巴結(jié)附近皮下共1ml。如淋巴結(jié)未腫大或腫大不明顯時(shí),直接注入兩側(cè) 窩及鼠蹊部皮下。
(4)間隔7-10天后,從耳靜脈采血0.5~1.0ml,分離血清,以雙相瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)測定免疫血清的抗體效價(jià)(即試血)。效價(jià)至少應(yīng)達(dá)到1∶16以上時(shí)才能放血。
(5)若效價(jià)未達(dá)到要求,可用不加佐劑的抗原液(人IgG)耳靜脈內(nèi)注射免疫。即于1周內(nèi)注射3次,分別為0.1、0.3、0.5ml。間隔1周再試血。如效價(jià)達(dá)到要求應(yīng)立即放血。另外,也可在第2次免疫后,以弗氏不*佐劑(FIA)乳化的抗原(人IgG)(簡稱FIA-IgG)再免疫1-2次。注射部位、劑量和間隔均同第2次,再試血測抗體效價(jià),如效價(jià)達(dá)到要求立即放血。
二、放血:
(一) 心臟采用血法
(1)家兔仰面,四肢縛于動(dòng)物固定架上(或由助手抓住四肢固定);
(2)剪去左胸部兔毛,消毒皮膚;
(3)用左姆指摸到胸骨劍突處,食指及中指放在右胸處輕輕向左推心臟,并使心臟固定于左胸側(cè)位置。然后,以左拇指觸摸心臟搏動(dòng)zui強(qiáng)的部位;
(4)用50ml注射器(連接16號(hào)針頭),傾針45°角度,對準(zhǔn)心搏zui強(qiáng)處刺入心臟抽血致死;
(5) 將抽取的血液立即注入無菌三角燒瓶中,待凝固后分離血清。
(二) 頸動(dòng)脈放血法
(1)家兔仰臥同上固定。頭部略放低以暴露頸部。剃毛及消毒皮膚;
(2)沿頸部中線切開皮膚約10cm,分離皮下組織,直至暴露出氣管兩側(cè)的胸鎖乳突?。?br>(3) 分離胸鎖乳突肌與氣管間的頸三角區(qū)疏松組織,暴露出頸總動(dòng)脈后使之游離;
(4)于動(dòng)脈下套入兩根黑絲線,分別置于遠(yuǎn)心及近心端。結(jié)扎遠(yuǎn)心端的絲線。近心端的動(dòng)脈用血管夾夾??;
(5)用尖頭小剪刀在兩根絲線間的動(dòng)脈璧上剪一小口,插入塑料放血管。再將近心端的絲線結(jié)扎固定于放血管上,以防放血管滑脫;
(6)松開血管夾,使血液流入滅菌三角燒瓶中。一般一只家兔可放血80~100ml。
三、分離血清:將三角燒瓶的血置37℃溫箱1小時(shí),再置4℃冰箱內(nèi)3~4小時(shí)。待血液凝固血塊收縮后,用毛細(xì)滴管吸取血清。于3000rpm離心15分鐘,取上清加入防腐劑(0.01%硫柳汞或0.02%疊氮鈉,zui終濃度),分裝后置4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?br>結(jié)果鑒定:
以雙相瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn)測定所獲免疫血清的抗體效價(jià),并用瓊指免疫電泳鑒定免疫血清中抗體的質(zhì)量,應(yīng)產(chǎn)生單一的沉淀弧線。鑒定方法的具體步驟參見有關(guān)部分。
注意事項(xiàng):
1. 免疫用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的抗體反應(yīng)性個(gè)體差異性較大,因此免疫時(shí)至少應(yīng)選用兩只以上動(dòng)物。另外,不能使用妊娠動(dòng)物。
2. 免疫用的抗原必須經(jīng)FCA或FIA充分乳化后才能注射,否則將明顯影響抗原的免疫效果。上述制備乳化抗原的方法較費(fèi)時(shí)、費(fèi)力。采用H-81微型振蕩混合器法或三腔管研磨法制備。前者是將抗原液與佐劑按比例混合后,置于混合器上使之劇烈振蕩(頻率2900轉(zhuǎn)/分,振幅6mm);后者是將免疫用的佐劑和抗原液按比例混合后,吸入注射器內(nèi)再將注射器連接于三腔管上反復(fù)抽吸研磨。這兩種方法約1小時(shí)即可使抗原充分乳化。
3. 佐劑一方面可提高特異性免疫反應(yīng)的效果獲得價(jià)的免疫血清,但若抗原不純時(shí),可使抗原中極微量的污染物(0.005mgN)產(chǎn)生抗體,以致導(dǎo)致免疫血清的純度受到影響。另外,有些實(shí)驗(yàn)動(dòng)物種系對BCG過敏,尤其是豚鼠其次是家兔,當(dāng)再次注射*佐劑時(shí),可以引起變態(tài)反應(yīng)而導(dǎo)致免疫失敗。為此,第二次免疫注射時(shí)應(yīng)減少佐劑中BCG的含量或改用不*佐劑,以減少和防止變態(tài)反應(yīng)的發(fā)生。
4. 抗原的劑量決定于抗原的種類。對免疫原性強(qiáng)的抗原劑量應(yīng)相別較少,免疫原性弱的抗原劑量可相對較多??乖挠昧恳话阋泽w重計(jì)算。在使用佐劑的情況下,一次注入的總劑量以0.5mg/kg體重為宜。如不加佐劑時(shí)劑量可加大10倍。另外,免疫周期長者可少量多次注射,免疫周期短者可較大量少次注射。
5. 免疫方法上也可采用多點(diǎn)注射法免疫動(dòng)物。即于家兔脊柱兩旁選4-6點(diǎn)皮下注射,同時(shí)于兩側(cè)肩部(或臂部)和鼠蹊部各注一處。每點(diǎn)注0.2ml,間隔2周后再于上述部位選不同點(diǎn)同上注射,也可產(chǎn)生價(jià)的免疫血清。

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