ELISA試劑盒雙抗體夾心法是查看抗原zui常用的方法,操作過程如下:
將特異性抗體與固相載體聯(lián)合,構成固相抗體。
洗刷除去別的未聯(lián)絡物質。
加酶標抗體,保溫反應。固相免疫復合物上的抗原與酶標抗體聯(lián)絡。
洗刷除去未聯(lián)絡的抗體及雜質。
加受檢標本,保溫反應。標本中的抗原與固相抗體聯(lián)絡,構成固相抗原抗體復合物。
*洗刷未聯(lián)絡的酶標抗體。
此時固相載體上帶有的酶量與標本中受檢抗原的量有關。
抗體的來歷為抗血清,包被和酶標用的抗體分別取自不一樣種屬的動物。
如運用單克隆抗體,一般挑選兩個關于抗原上不一樣抉擇簇的單抗,分別用于包被固相載體和制備酶聯(lián)絡物。
類同于堆積反應中抗原過剩的后帶現象,此時反應后顯色的吸光值(位于抗原過剩帶上)與標準曲線(位于抗體過剩帶上),如按常法測讀,所得效果將低于實踐的含量,這種現象被稱為鉤狀效應(hook effect),由于標準曲線到達后呈鉤狀彎落。
ELISA試劑盒雙抗體夾心法鉤狀效應嚴重時,反應乃至可不顯色而出現假陰性效果。
雙抗體夾心法適用于測定二價或二價以上的大分子抗原,但不適用于測定半抗原及小分子單價抗原,因其不能構成兩位點夾心。
在臨床查驗中,此法適用于查驗各種蛋白質等大分子抗原,例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。
只需獲得關于受檢抗原的異性抗體,就可用于包被固相載體和制備酶聯(lián)絡物而樹立此法。
在一步法測定中,當標本中受檢抗原的含量很高時,過量抗原分別和固相抗體及酶標抗體聯(lián)絡,而不再構成"夾心復合物"。
運用一步法試劑測定標本中含量可反常增高的物質(例如血清中HBsAg、AFP和尿液hCG等)時,應留心可測規(guī)模的zui高值。用高親和力的單克隆抗體制備此類試劑可削弱鉤狀效應。
假使在被測分子的不一樣位點上富含多個一樣的抉擇簇,例如HBsAg的a抉擇簇,也可用關于此抉擇的同一單抗分別包被固相和制備酶聯(lián)絡物。
但在HBsAg的查看中應留心亞型疑問,HBsAg有adr、adw、ayr、ayw4個亞型,雖然每種亞型均有一樣的a抉擇簇的反應性,這也是用單抗作夾心法應留心的疑問。
ELISA試劑盒雙抗體夾心法測抗原的另一留心點是類風濕因子(RF)的煩擾。
RF是一種自身抗體,多為IgM型,能和多種動物IgG的Fc段聯(lián)絡。
用作雙抗體夾心法查看的血清標本中如富含RF,它可充任抗原成份,一起與固相抗體和酶標抗體聯(lián)絡,表現出假陽性反應。
選用F(ab')或Fab片段作酶聯(lián)絡物的試劑,由于去除了Fc段,然后消除RF的煩擾。
ELISA試劑盒雙抗體夾心法本法關鍵在于酶標抗原的制備,應根據抗原結構的不一樣,尋覓適合的符號方法。